靶向不可成药靶点KRAS[1]
KRAS简介- RAS是GTPase原癌基因家族成员，包括三个密切相关的RAS亚型：HRAS、KRAS和NRAS。在所有RAS亚型中，KRAS突变频率最高，其次是NRAS和HRAS。KRAS突变在胰腺癌、肺癌和结直肠癌中尤为常见。在癌症中最常爆发突变的残基是G12、G13和Q61。KRAS卵白保存两种剪接变体KRAS4A和KRAS4B，其中KRAS4B在人类细胞中占主导职位。KRAS(Kirsten rat sarcoma 2 viral oncogene homolog，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物)基因是编码GTP/GDP结合卵白的原癌基因，属于GTPase RAS家族。KRAS卵白作为分子开关，在GDP结合的无活性状态和GTP结合的活性状态之间循环。KRAS卵白划分通过与GTP和GDP结合，在无活性形式和活性形式之间转换。虽然KRAS卵白具有内在的核苷酸交换和GTP水解，但其细胞信号传导状态是由鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)激活引起的，如催化GTP结合的SOS(son of sevenless)和Ras鸟嘌呤核苷酸释放卵白，以及GTPase激活卵白(GAPs)催化的去激活作用，如刺激GTP水解的p120GAP和神经纤维卵白(NF1)。
KRAS GTPase循环[1]
KRAS结构- KRAS卵白包括四个结构域。在三种RAS亚型中，N端的第一个结构域是相同的，第二个结构域的序列相似性相对较低。这两个区域对KRAS卵白的信号功效都很重要，并配合形成了G-结构域。KRAS卵白分子量为21 kDa，由6条β-折叠链(形成卵白焦点)和5条α螺旋结构组成，形成两个主要结构域：G结构域和C端结构域。KRAS的G结构域由残基1-166组成，包括GTP结合口袋，该区域关于下游效应物和GTPase激活卵白(GAPs)之间的相互作用至关重要。G结构域是高度守旧的，包括卖力GDP-GTP交换的switch I和switch II区域。C端是一个包括CAAX (C=半胱氨酸，A=任意脂肪氨基酸，X=任意氨基酸)基序的高变区，引导翻译后修饰并决定细胞膜锚定。该区域在RAS卵白的生物活性调控中起着重要作用。
KRAS的晶体结构[2]
KRAS二级结构的二维示意图[2]
KRAS信号通路- KRAS是激活一系列信号分子的上游信号传感器之一，能够转导信号从细胞外貌通报到细胞核，并调控一系列基本的细胞历程，如细胞剖析、生长、趋化和凋亡。除了上述GTP/GDP结合外，KRAS信号的激活现在被认为是一个多办法的历程，需要适当的KRAS翻译后修饰、细胞膜定位和与效应卵白的相互作用。KRAS卵白的信号转导并不但爆发在细胞膜上。KRAS对下游信号通路的激活也可以由亚细胞区域(如内质网和高尔基体)的信号触发。在细胞外刺激作用下，从失活的RAS-GDP到激活的RAS-GTP的转化进一步增进了多种信号通路的激活，包括MAPK通路、PI3K通路和Ral-GEFs通路，其中以MAPK通路的特征最为明显。已知RAS-GTP直接与RAF卵白结合，将RAF激酶家族从细胞质招募到膜上，在细胞膜上二聚化并活化。激活的RAF随后对其下游底物，即MEK和ERK进行一系列磷酸化反应，并传导生长信号。
主要的KRAS效应通路[1]
KRAS卵白的结晶研究- 高通量结晶筛选1000+筛选条件
- 上海同步辐射光源 (Shanghai Synchrotron Radiation Facility; SSRF)庄闲官网加入了上海光源的设计、建设和治理，这是一个用于大分子晶体学的工业光束线站，大分子光束线于2009年7月开通。
工业用大分子晶体学线站卓越的光束线和效劳 更低的本钱 3.5 GeV存储环 全年运营紧邻张江高科技园区和浦东机场 - 研究案例KRAS-G12D
KRASG12D的筛选
KRASG12D的X射线衍射数据KRAS-G12D with MRTX1133
共晶的筛选
共晶的X射线衍射数据KRAS-G12D
KRASG12D与7RPZ的结构比较，绿色为PDB ID 7RPZ，粉色为庄闲官网的数据。这些数据关联性很是强。KRAS-G12D with MRTX1133
KRASG12D与MRTX1133的共结晶结构(7RPZ, PDB)比较，绿色结构为PDB ID 7RPZ，青色为庄闲官网的数据。这些数据关联性很是强。KRAS-G12D with MRTX1133
与GDP结合的KRASG12D与MRTX1133的共晶结构
KRAS靶向药物的体外研究- 在研究和开发的初始阶段，体外功效剖析对候选KRAS靶向药物的实际评估至关重要。这些剖析为验证KRAS靶向药物活性提供了科学依据，并提供了支持治疗效果的开端证据。因此，它们在KRAS靶向候选药物选择的决策历程中起着要害作用。KRAS细胞试验庄闲官网已经验证了KRAS突变细胞系的细胞毒性测试要领，2D和3D试验均可用于KRAS抑制剂的评估。
通过CellTiter-Glo检测2D细胞增殖试验
- 细胞毒性试验(3D)NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity Assay (3D)
以1 μM起始浓度、按1:3连续稀释的药物处理NCl-H358细胞288 h后，显微镜检测细胞毒性结果。
- NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity CTG Assay (2D; 3 days)
以1 μM起始浓度、1:3连续稀释的药物处理NCI-H358细胞72 h后，CTG测定细胞毒性。
- NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity CTG Assay (3D;12 days)
以1 μM起始浓度、1:3连续稀释的药物处理NCI-H358细胞288 h后，显微镜测定细胞毒性。
- 基于卵白的生化活性试验
Kras G12C-SOS1结合的IC50活性测试筛选试验化合物
- 鸟嘌呤核苷酸交换试验
KRAS在含有1mM BODIPY FL-GDP, 20 mM HEPES pH 7.6, 10 mM EDTA, 20 mM硫酸铵和1 mM DTT的溶液中，在4°C下孵育48小时。用20 mM MgCl2溶液停止反应。将含有KRAS卵白的BODIPY-FL-GDP浓缩去除BODIPY-FL-GDP。图A：试验要领的MoA
KRAS靶向药物的药理药效学研究- KRAS突变-CDX模型
Cancer Type Cell Lines KRAS G12C MIA PaCa-2, NCI-H358, UM-UC-3, Calu-1 KRAS G12D GP2D, SW1990, AsPC-1 KRAS G12V SW480, CAPAN-1, NCI-H727 KRAS G13D LoVo, HCT-116, HT15 Medicilon Case: CDX - KRAS Mutation (G12C)
PDX重要突变/过表达/耐药模型GENE PDX ID KRAS Mutation PDXM-060C (p.G12V), PDXM-069C (p.G12V),PDXM-075C (p.G12D), PDXM-076C (p.G13D),PDXM-212Li (p.G12D) TP53 Mutation PDXM-060C (p.R273H), PDXM-072C(p.Y234H) PIK3CA Mutation PDXM-075C (p.H1047L), PDXM-092Ga (p.E545G) BCR-ABL Fusion PDXM-242Le ERBB2 Overexpression PDXM-069C, PDXM-016C, PDXM-060C, PDXM-087C, PDXM-104C… ... ... Resistance* PDX ID Docetaxel + Cisplatin PDXM-271O (Ovarian cancer) VDLP + MA + CVAD PDXM-293Le (Leukemia) Radiation PDXM-311(H&N) ... ... * note: these resistance models are not related to KRAS mutation
- Medicilon Case: PDX -- KRAS Mutation (G12D)
Medicilon Case: AMG-510 Resistant Model - Calu-1 (G12C)
野生型肺癌模型
耐药肺癌模型(通过体内治疗2个周期(P2)建立，每个周期2个月。这里展示的是P3结果。
KRAS靶向药物的药代动力学研究- 庄闲官网为KRAS靶向药物PK研究的要害参数提供高质量的定量剖析，结果准确。庄闲官网案例：KRAS-PDEδ抑制剂的药代动力学KRAS-PDEδ卵白-卵白相互作用是癌症治疗的一个极具吸引力的靶点。设计并合成了一系列高效的PROTAC PDEδ降解剂。最有潜力的Compound 17f是治疗KRAS突变型结直肠癌的PROTAC PDEδ降解剂。Compound 17f为KRAS-PDEδ相互作用的可成药性研究提供了新的化学工具或先导化合物。Compound 17f在SW480结直肠癌异种移植模型中具有显著的抑制肿瘤生长作用。这项验证研究为靶向KRAS-PDEδ相互作用的可成药性提供了新的战略，并为治疗KRAS突变型癌症提供了有效的先导化合物。
PROTAC战略和KRAS-PDEδ抑制剂Compound 17f[3]
- 接纳Sprague-Dawley (SD)大鼠进行Compound 17f的药代动力学研究。在剂量为50 mg/kg下腹腔注射给药后，剖析Compound 17f在血浆中的浓度。这些试验由庄闲官网进行。Compound 17f的半衰期约为5.1 h，峰值浓度Cmax为564 ng/mL。虽然Compound 17f的分子量较大(MW=723)，但能在大鼠体内有效吸收并抵达足够的血浆袒露量，其曲线下面积(AUC)值为4710 h·ng/mL。
Compound 17f在大鼠体内的PK参数[3]
庄闲官网助力KRAS项目举例- 2022年5月，NMPA批准了信诺维抗肿瘤1类新药XNW14010的临床申请，拟用于治疗伴有KRAS G12C突变的晚期实体瘤。XNW14010是一种高选择性的小分子KRASG12C卵白共价结合抑制剂。临床前实验数据显示XNW14010在差别的肿瘤模型中均有良好的抗肿瘤活性，且泛起良好的量效关系，并具有良好的经口给药药代动力学特征和较为理想的宁静窗口。庄闲官网作为信诺维的相助同伴，为XNW14010的研发提供了（包括药代和宁静性评价在内）综合性临床前研究效劳，为项目获批临床提供了有力支撑。
- 劲方医药科技（上海）有限公司研发的氟泽雷塞，是一款高效口服KRAS G12C小分子抑制剂，通过共价不可逆修饰KRAS G12C卵白突变体半胱氨酸残基，抑制该卵白介导的GTP/GDP交换从而下调KRAS卵白活化水平。依托成熟的药代动力学研究平台，庄闲官网为氟泽雷塞提供了早期阶段的动物实验药物代谢动力学效劳，助力氟泽雷塞的早期开发。
- 参考文献：
[1] Pingyu Liu, et al. Targeting the untargetable KRAS in cancer therapy. Acta Pharm Sin B. 2019 Sep;9(5):871-879. doi: 10.1016/j.apsb.2019.03.002.
[2] Tatu Pantsar. The current understanding of KRAS protein structure and dynamics. Comput Struct Biotechnol J. 2019 Dec 26:18:189-198. doi: 10.1016/j.csbj.2019.12.004.
[3]Junfei Cheng, et al. Discovery of Novel PDEδ Degraders for the Treatment of KRAS Mutant Colorectal Cancer. J Med Chem. 2020 Jul 23;63 (14):7892-7905. doi: 10.1021/acs.jmedchem.0c00929.
[4]Gongmin Zhu, et al. Role of oncogenic KRAS in the prognosis, diagnosis and treatment of colorectal cancer. Mol Cancer. 2021 Nov 6;20(1):143. doi: 10.1186/s12943-021-01441-4.
[5]Tamas Yelland, et al. Stabilization of the RAS:PDE6D Complex Is a Novel Strategy to Inhibit RAS Signaling. J Med Chem. 2022 Feb 10;65 (3):1898-1914. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c01265.
[6]Timothy H Tran, et al. KRAS interaction with RAF1 RAS-binding domain and cysteine-rich domain provides insights into RAS-mediated RAF activa-tion. Nat Commun. 2021 Feb 19;12(1):1176. doi: 10.1038/s41467-021-21422-x.
